单细胞转录组（2）单细胞测序原理

1. 细胞捕获分选技能

a微吸管分离
b显微镜 辅助毛细管捕获
c荧光标志 细胞分选（ FACS
d激光捕获显微 分离 (
e微流控
f抗体 磁 珠 分选 MACS
g微液滴
单细胞测序的关键在于如何举行单细胞的捕获和分选，这是决定单细胞检测成本和通量的关键步调。不同的单细胞测序平台重要差异也在于单细胞捕获分选的方法。
1.1 细胞分选技能

细胞分选技能可以分为特异性分选和非特异性分选两大类：

• 特异性分选：
  
  
  
  • 微吸管分离：通过显微操作技能，用微吸管手动挑选单个细胞。
    
  • 激光捕获显微分离（LCM）：利用激光将目的细胞从组织切片中分离出来。
    
  • 荧光激活细胞分选（FACS）：基于细胞外貌荧光标志物，通过流式细胞仪分选目的细胞。
    
  • 抗体磁珠分选（MACS）：利用抗体偶联的磁珠，通过磁场分选目的细胞。
    
  • 优点：能够精确分选目的细胞。
    
  • 缺点：通量低，依靠已知标志物，成本高，操作复杂。
    
  
  
• 非特异性分选：
  
  
  
  • 微流控技能：通过微流控芯片的微通道和微腔室，将单细胞分离并捕获。
    
  • 微液滴技能：将单细胞和反应试剂包裹在纳米级液滴中，每个液滴包含一个细胞和一个带有条形码的珠粒。
    
  • 微孔技能：利用蜂窝板上的微孔，让单细胞悬液流过并落入微孔中。
    
  • 优点：通量高，恰当大规模单细胞测序。
    
  • 缺点：无法特异性分选目的细胞，必要后续分析筛选。
    
  
  

1.2 特异性分选类技能（低通量）

早期单细胞测序技能（如SMART-seq）重要基于特异性分选，但存在以下局限：

• 细胞分选服从低，一次只能分选少量细胞。
  
• 依靠已知标志物，难以发现新的细胞类型。
  
• 检测成本高，不恰当大规模研究。
  

1.3 非特异性分选类技能（高通量）

现在主流的单细胞测序平台（如10x Genomics、BD Rhapsody）均接纳非特异性分选技能，能够一次捕获数千个细胞，大大进步了通量和服从。

---

2. 不同单细胞测序平台比较

单细胞测序平台的选择取决于实验需求、预算以及研究目的。不同的平台在通量、成本、操作复杂性以及数据分析难度等方面存在显著差异。以下是一些常见单细胞测序平台的比较：
技能类型代表性技能通量优点缺点微流控芯片Fluidigm C196个细胞/芯片通量适中，恰当少量细胞的高精度分析通量有限，成本较高微液滴10x Genomics3000-8000个细胞/芯片高通量，恰当大规模单细胞测序数据复杂，分析难度大微孔技能BD Rhapsody20万+微孔高通量，恰当大规模单细胞测序操作复杂，成本较高2.1 微流控芯片技能

• 代表性技能：Fluidigm C1
  
• 通量：一次最多可以捕获96个单细胞。
  
• 优点：
  
  
  
  • 高精度：恰当对少量细胞举行高精度的分析。
    
  • 自动化程度高：操作相对简单，恰当实验室常规利用。
    
  
  
• 缺点：
  
  
  
  • 通量有限：一次只能处理96个细胞，对于大规模研究不够用。
    
  • 成本较高：芯片成本较高，不恰当大规模单细胞测序。
    
  
  

2.2 微液滴技能

• 代表性技能：10x Genomics
  
• 通量：一次可以处理3000-8000个单细胞。
  
• 优点：
  
  
  
  • 高通量：能够一次处理数千个单细胞，恰当大规模研究。
    
  • 成本较低：单个细胞的测序成本相对较低。
    
  • 数据丰富：能够提供丰富的基因表达信息。
    
  
  
• 缺点：
  
  
  
  • 数据分析复杂：产生的数据量大，分析难度较高。
    
  • 多细胞污染：存在肯定的多细胞污染风险，必要后续分析筛选。
    
  
  

2.3 微孔技能

• 代表性技能：BD Rhapsody
  
• 通量：蜂窝板上有20万+微孔，理论上可以处理大量单细胞。
  
• 优点：
  
  
  
  • 超高通量：恰当处理大量单细胞，恰当大规模研究。
    
  • 机动性高：可以同时处理多个样本，恰当多组学分析。
    
  
  
• 缺点：
  
  
  
  • 操作复杂：实验操作较为复杂，必要专业的技能人员。
    
  • 成本较高：设备和耗材成本较高。
    
  
  

---

3. 10x Genomics 单细胞测序技能

10x Genomics 是现在最主流的单细胞测序平台之一，其核心技能包罗 GEM（Gel Beads-in-Emulsion）、Barcode 和 UMI（Unique Molecular Identifier）。这些技能的结合使得 10x Genomics 平台能够实现高通量、低成本的单细胞测序。
3.1 GEM（Gel Beads-in-Emulsion）

• GEM 结构：
  图中展示的是10x Genomics单细胞测序技能中利用的GEM（Gel Beads-in-Emulsion，凝胶珠-油包水）结构。GEM是10x Genomics单细胞测序技能的核心构成部分，它允许在单个细胞程度上举行基因表达的捕获和测序。
  

• 凝胶珠（Gel Bead）：这是一个微小的凝胶珠，内部包含有用于后续逆转录和扩增的引物。
  
• 10x Barcode：这是一段16个碱基对（nt）的独特序列，每个凝胶珠上的Barcode都是唯一的，用于在测序后区分来自不同细胞的RNA分子。
  
• UMI（Unique Molecular Identifier，独特分子标识符）：这是一段12个碱基对的序列，用于在同一个细胞内区分不同的转录本，并在后续分析中去除PCR扩增过程中产生的重复序列，从而实现更准确的基因表达定量。
  
• Poly(dT)引物：这是一段30个碱基对的poly(dT)序列，用于捕获细胞中的mRNA分子。mRNA的poly(A)尾巴会与poly(dT)引物结合，从而使得mRNA模板可以被逆转录成cDNA。
  

在单细胞测序过程中，每个细胞被包裹在自己的GEM中，如许每个细胞的mRNA分子都会被逆转录并加上特定的Barcode和UMI。这个过程发生在油包水的液滴中，每个液滴相当于一个微型反应室。随后，这些液滴被打破，释放出含有cDNA的凝胶珠，这些cDNA可以被进一步扩增并准备举行高通量测序。

• 作用：
  
  
  
  • 每个 GEM 中的细胞独立举行裂解、反转录和扩增，最终形成单细胞测序文库。
    
  • 通过 Barcode 和 UMI，可以将测序结果拆分到单个细胞，并去除 PCR 重复。
    
  
  

3.2 Barcode

Barcode 是一段 14-16bp 的标签序列，每个 GEM 中的 Barcode 不同，用于区分不同的细胞。10x Genomics 平台每次反应可以投入约 75 万个 GEM，远远大于细胞数目。

• 作用：
  
  
  
  • 通过 Barcode 序列，可以将测序结果拆分到单个细胞。
    
  • 每个细胞的 Barcode 唯一，用于标志细胞泉源。
    
  
  
• 特点：
  
  
  
  • Barcode 序列在测序过程中用于区分不同细胞的转录本。
    
  • 10x Genomics 芯片同时可以上样 8 个文库，不同文库可以利用雷同的 Barcode，但为了保证整合多个文库时 Barcode 不发生冲突，通常会在 Barcode 后面加一个数字标志其泉源的文库。
    
  
  

3.3 UMI（Unique Molecular Identifier）

UMI 是单分子识别码，长度为 10-12bp，用于区分同一细胞中的不同转录本并去除 PCR 重复。

• 作用：
  
  
  
  • 通过 UMI，可以准确盘算基因表达量，制止 PCR 扩增带来的偏差。
    
  • UMI 在 cDNA 分子扩增前加入，用于识别并去除技能重复。
    
  
  
• 特点：
  
  
  
  • UMI 测序可以在 PCR 扩增之前标志每个分子，从而在后续分析中区分真实信号和 PCR 重复。
    
  • UMI 的利用进步了基因表达定量的准确性和可靠性。
    
  • 
    
    先根据barcode区分细胞，然后根据umi去除重复
    
  
  

3.4 GEM 与 Barcode 以及 UMI 之间的关系

• GEM 是反应体系：包含 Barcode 和 UMI。
  
• 不同 GEM 中的 Barcode 不同：用于区分不同的细胞。
  
• 同一 GEM 中的 UMI 不同：用于区分同一细胞中的不同转录本。
  
• Barcode 代表细胞：用于标志细胞泉源。
  
• UMI 代表测序 reads：用于标志单个转录本。
  

总结

10x Genomics 单细胞测序技能通过 GEM、Barcode 和 UMI 的结合，实现了高通量、低成本的单细胞测序。这些技能的结合不但进步了单细胞测序的通量，还进步了数据的准确性和可靠性。10x Genomics 平台因其高效性和经济性，已成为单细胞测序范畴的主流选择。

---

4. 10x Genomics 单细胞测序文库构建及测序

10x Genomics 单细胞测序技能是一种革命性的方法，它通过将每个单细胞封装在独立的油滴中，与凝胶珠（GEM）结合，从而实现高通量、高服从的单细胞测序。以下是详细的文库构建及测序步调：
4.1 文库构建步调

• 单细胞悬液制备：首先，必要从组织或细胞样本中制备出高质量的单细胞悬液。这一步调对后续分析的准确性至关紧张。
  
• 细胞计数和活率检测：调解细胞浓度至700-1200个细胞/μL，并确保细胞活率高于80%，以保证测序结果的可靠性。
  
• GEM生成：利用微流控芯片技能，将带有唯一Barcode和UMI序列的凝胶珠与单细胞一起包裹在油滴中，形成GEM结构。每个GEM包含一个单细胞、一个凝胶珠和一个油滴。
  
• 细胞裂解和反转录：在油滴中，细胞被裂解，释放的mRNA与凝胶珠上的Barcode和UMI序列相连，举行逆转录反应形成cDNA。
  
  
  
  1：PolyA+ RNA捕获
  

• 过程：这条mRNA分子的3’端有一个polyA尾巴。我们利用带有寡聚T（polyT）的磁珠来捕获这个polyA尾巴，从而将这条mRNA从细胞中的全部RNA分子中分离出来。
  
• 结果：我们乐成捕获了这条mRNA分子。
  

2：RNA片段化和引物结合

• 过程：捕获的mRNA分子被切割成较小的片段（比方200-300个核苷酸）。然后，我们利用随机引物或oligo(dT)引物与这些RNA片段结合，为后续的反转录做准备。
  
• 结果：每个RNA片段都与一个引物结合，准备举行反转录。
  

3：第一条链cDNA合成

• 过程：反转录酶利用引物和四种脱氧核苷酸（dNTPs）作为原料，根据RNA片段的序列合成第一条cDNA链。这条链是与原始mRNA序列互补的。
  
• 结果：我们得到了与原始mRNA序列互补的第一条cDNA链。
  

4：第二条链cDNA合成

• 过程：为了得到双链cDNA，我们利用DNA聚合酶合成第二条链。这个过程可能涉及到RNA模板的置换或利用RNAse H降解RNA模板，然后合成第二条cDNA链。
  
• 结果：我们得到了双链cDNA分子。
  

5：3’端加A和5’端修复

• 过程：在cDNA的3’端添加腺嘌呤（A）突出端，并对5’端举行修复，以便于后续讨论的连接。
  
• 结果：cDNA分子的两端被修饰，准备好连接测序讨论。
  

6：连接DNA测序讨论

• 过程：在cDNA分子的两端分别连接上测序所需的讨论（adapters）。这些讨论包含了用于PCR扩增的引物结合位点以及测序所需的序列。
  
• 结果：cDNA分子的两端被连接上了测序讨论，形成了测序文库片段。
  

7：连接片段的PCR扩增

• 过程：利用讨论上的引物举行PCR扩增，以增长文库的量，准备举行高通量测序。在这个过程中，我们可能会加入条形码（barcode）以区分不同样本。
  
• 结果：我们得到了大量的测序文库片段，每个片段都带有条形码，可以区分不同的样本。
  

• 破乳和文库构建：通过破乳过程，将油滴打破，释放出含有cDNA的凝胶珠。然后，将全部cDNA混合，举行文库构建，准备举行高通量测序。
  
• 上机测序：利用Illumina测序平台举行高通量测序，获取每个细胞的基因表达信息。
  

4.2 10x Genomics 单细胞测序平台上风

• 真正单细胞测序：通过GEM技能实现真正意义上的单细胞测序。
  
• 超高细胞通量：一次可检测500-80000个细胞，恰当大规模研究。
  
• 细胞捕获服从高：单细胞捕获服从高达65%，能够准确辨别有数细胞类型。
  
• 细胞可适性高：对细胞巨细和类型无穷制，实用于多种细胞类型。
  
• 多态率低：多态率（包含多个细胞的GEM）低于0.9%/1000细胞，保证了数据的准确性。
  
• 时间周期短：从细胞悬液到cDNA文库构建的整个过程可以在1天内完成。
  
• 性价比高：单个细胞的测序成本低，恰当大规模应用。
  

---

5. 10x Genomics 单细胞测序平台上风

10x Genomics 单细胞测序平台因其独特的设计和高效的工作流程，在单细胞测序范畴中占据了紧张职位。以下是该平台的重要上风：
5.1 真正单细胞测序

10x Genomics 技能通过微流体“双十字”交错系统分选单个细胞，并通过 barcode 磁珠-单细胞-油滴的对应关系形成 GEM（Gel Beads-in-emulsion），实现真正意义上的单细胞测序。这种方法确保了每个细胞的基因表达数据都是独立捕获和分析的，从而进步了数据的准确性和可靠性。
5.2 超高细胞通量

微流体“双十字”交错系统为 8 通道系统，每个通道最高可捕获 10000 细胞，8 通道一次可检测细胞范围为 500-80000 个细胞。这种高通量的能力使得研究人员能够在短时间内分析大量的单细胞，非常恰当大规模的单细胞研究。
5.3 细胞捕获服从高

单个细胞捕获服从高达 65%，这意味着在实验过程中可以准确辨别有数细胞类型，对于有数样本或小细胞量类型样本研究尤为紧张。
5.4 细胞可适性高

该平台对细胞巨细（直径超过 40um 细胞必要制备成细胞核）及类型无穷制，这使得它可以广泛应用于不同类型的细胞和组织样本。
5.5 多态率低（Multiplet Rate）

多态率（同一个 GEM 包含 2 个及 2 个以上细胞）低于 0.9%/1000 细胞。这种低多态率确保了大多数 GEM 中只包含一个细胞，从而淘汰了数据中的噪声和复杂性。
5.6 时间周期短

自动化分离过程，无需人工操作，1 天内可完成从细胞悬液到 cDNA 文库构建的全部测序准备工作。这种快速的流程大大缩短了实验周期，进步了研究服从。
5.7 性价比高

单个细胞成本低于其他单细胞平台，使得大规模的单细胞测序研究更加经济可行。
总结

10x Genomics 单细胞测序平台通过其高效、高通量和低成本的特点，为单细胞基因表达分析提供了强盛的工具。这些上风使得该平台在单细胞研究范畴中非常受欢迎，实用于各种生物学和医学研究。

---

6. 常见问题

在单细胞测序的实践中，研究人员可能会遇到一些常见问题。以下是这些问题的详细解释和解答：
6.1 为什么不做单细胞DNA测序？

• 原因：同一个体的细胞DNA基本雷同，重要的变异通常在转录程度上，即基因表达的差异。别的，DNA测序的数据量非常大，成本较高，而且现有的单细胞DNA测序重要用于检测拷贝数变异（CNV）等特定类型的遗传变异。
  

6.2 单细胞测序与三代测序结合？

• 可能性：现在主流的单细胞测序重要接纳二代测序技能，由于其成本较低，且重要用于计数，对片段长度要求不高。然而，单细胞测序也可以与三代测序结合，以利用三代测序的长读长上风，但这通常必要特殊的建库方法。
  

6.3 原核生物是否可以做单细胞测序？

• 限制：原核生物不具有polyA尾巴，这是单细胞测序中用于捕获mRNA的关键结构。因此，现在无法利用常规的单细胞测序方法对原核生物举行测序。
  

6.4 植物可以做单细胞测序吗？

• 可行性：可以，但植物细胞具有细胞壁，这使得在制备单细胞悬液时必要接纳特殊的方法。别的，植物细胞的基因表达调控机制可能与动物细胞有所不同，因此在分析时必要特殊注意。
  

6.5 单细胞测序数据量

• 数据量盘算：单细胞测序的数据量与细胞数目正相关。比方，测序5000个细胞，每个细胞5万条reads，根据测序文库的reads长度，可以盘算出总数据量。这通常必要大量的存储空间和盘算资源。
  

6.6 测序饱和度

• 饱和度解释：单细胞测序每个细胞的reads数远低于饱和，但通过大量细胞重复，整体数据量可以达到饱和。有研究表明，每个细胞测序2~3k reads，也可以得到很好的分群准确性。
  

6.7 单细胞测序是否必要对照组？

• 对照组需求：单细胞测序一样平常不必要对照组，由于其重要目的是判定整个组织的细胞类型，而非不同样品之间表达差异的比较。通过组织内部不同组之间比较差异表达基因即可。
  

6.8 单细胞测序是否必要加入内参？

• 内参需求：单细胞测序一样平常不必要内参。建库已经在GEM内部完成，不容易混合，且通过UMI可以准确判定表达的reads数目，接近于绝对定量，不必要加入内参。